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“恒远生物”产品文献:蛇床子素支架材料修复兔下颌骨缺损的实验研究

点击次数:96 发布时间:2019/3/28
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BMSCs/PRF复合载蛇床子素支架材料修复兔下颌骨缺损的实验研究
郭延伟 李松 房殿吉*
(佳木斯大学附属口腔医院颌面外科 黑龙江  佳木斯    154000)

 

[摘要] 目的:探讨 BMSCs/PRF 复合载蛇床子素支架材料修复兔下颌骨缺损的实验研究的可行性。方法:36 只新西兰大白兔随机分为3组,每组12只,双侧下颌骨制备缺损模型。A 组植入 BMSCs/PRF 复合载蛇床子素支架材料;B 组植入 BMSCs复合载蛇床子素支架材料,C 组单植入纳米羟基磷灰石支架材料。分别于术后2、4、8、12 周处死实验动物,制备组织标本,行大体观察、影像学分析、HE 染色、扫描电镜检测,并对影像学分析值及成骨情况加以评价,对分析数据结果使用SPSS17.0统计软件进行分析,P <0.05 有统计意义。结果:影像学检查及组织学染

色显示 A 组骨缺损处愈合程度,成骨速度及其质量明显优于 B组C 组;扫描电镜显示 A 组该复合材料与组织相容
性好,无炎症刺激反应;统计牙 CT 分析数据及新生骨面积,A 组的成骨情况明显优于B 组与C 组(P <0.05)。结论:BMSCs/PRF 复合载蛇床子素支架材料有明显骨诱导作用,是一种新型复合材料,可望成为临床应用中修复颌骨缺损的新型材料。
[关键词] 骨  颌骨缺损  骨髓间充质干细胞 BMSCs   富血小板纤维蛋白 PRF   蛇床子素 Osthol
[中图分类号] R782.4 [文献标识码] A [文章编号] 1671—7651(2012)11—1087—05
ResearchofBMSCs/PRFCompoundwiththeOstholScaffoldsforRepairtheMandibularDefectsoftheRabbit.GUO Yan-wei,LISong,FANG Dian-ji.DepartmentofOraland MaxillofacialSurgery,HospitalofStomato- logical,JiamusiUniversity,Jiamusi154004
[Abstract]  Objective:ToinvestigatethefeasibilityoftheBMSCs/PRFcompound withtheOstholscaffoldsfor
repairthemandibulardefectsoftherabbit.Methods:36 New Zealand whiterabbitswererandomlydividedinto3 groups.Bilateralmandibulardefectmodelwasprepared.A:groupofimplanted MSCs/PRFcompositescaffolds Osthol;B:groupimplantedBMSCscompositescaffoldscontainingOsthol,C:groupofsinglenano-hydroxyapa- titescaffoldsimplanted.Allexperimentalanimalsweresacrificedafter2,4,8,12 weekstopreparetissuesamples. Theobservationingeneralandradiographicanalysiswerecarriedout.HEdyeing,SEM detecting,andanalysisof thevalueoftheImagingandthebonewereperformed.Results:Invivoimagingandhistologicalstainingshowed thatbonedefectbonequalityofagroupwassignificantlybetterthanthoseofothergroups.SEM showedthewell compositematerialandtissuecompatibility,noinflammationreaction;BymeasuringandanalyzedthedentalCTda- taandnewbonearea,theAgroupbonewasobviouslybetterthantheothergroups (P <0.05).Conclusion:The BMSCs/PRFcompoundwiththeOstholscaffoldsforrepairthemandibulardefectsoftherabbithasobviousinduc- tionofbone.Itisanewcompositematerial,expectedtobecometheclinicalapplicationofnew materialstorepair themandibulardefects.
[Keywords]  Bone   MandibularDefects  BMSCs  Platelet-richfibrin(PRF)  Osthol

下颌骨功能结构复杂,而造成其缺损的原因也很多,若不及时进行修复或修复不当,则常常会造成骨不连或延迟愈合等严重后果。随着当代组织工程学及分子生物学的迅猛发展,利用干细胞作为种子细胞复合支架材料修复骨缺损成为近年来研究的热
基金项目  国家自然科学基金(编号:81170935)
作者简介   郭延伟(1985~  ),男,山东聊城人,硕士,主要从事口腔颌面外科的研究工作。
* 通讯作者  房殿吉,dian话:0454-8625581
点,骨髓间充质干细胞(BM- MSCs)以其多项分化的潜能及自身所具有的遗传背景稳定和对机体无免
疫排斥反应等优点成为理想的种子细胞[1~3]。PRF是继富血小板血浆(platelet-richplasma,PRP)后第2代血小板浓缩液,以血小板凝胶形式呈现,其所
内含的高浓度的生长因子能促进骨组织和软组织再生修复,单独或联合其他生物材料注人硬组织缺损或软组织创伤处,可以修补缺损,诱导生长,加速局部创伤的愈合并提高愈合质量[4~6]。实验证明,蛇


床子素 可 促 进 大 鼠 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (BM - MSCs)的增殖及向成骨细胞分化并抑制其向脂肪细胞分化,而且蛇床子素具有促进成骨细胞增殖的
能力[7,8]。本研究将骨髓间充质干细胞作为种子细胞,以载蛇床子素的羟基磷灰石为支架材料,结合
PRF 中多种生长因子及其诱导并促进成骨修复兔下颌骨缺损,为临床应用提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1   实验动物  健康新西兰大白兔36 只,体重2.
0~3.0kg,3~6月龄,雌雄不限,(由佳木斯大学动物实验中心提供),材料及仪器:医用纳米级羟基磷
灰石(上海源叶生物科技有限公司),蛇床子素(上海恒远生物科技有限公司),离心机,JSM -6360LV扫描电镜,倒置相差显微镜,牙 CT。
1.1.1   骨髓间充质干细胞的获取及培养   无菌条
件下,骨髓穿刺针兔双侧股骨大转子处抽取骨髓3
~5 mL,然后加入 20 mL 的 DMEM 培养液中混匀,过滤杂质后以1500r/min 离心20 min,离心完后取上层骨髓,加入5 mL 制成 DMEM 培养液制成单细胞悬液(细胞数为10 个/mL),然后置入容积为 30 mL 的培养瓶中,加入10mL 含20%新生小牛血清、青霉 素 100 U/mL、硫 酸链霉素 100g/mL 的 DMEM 培养液,再次离心1200r/min离心10 min,去上清,计数。然后置入37 ℃、5%CO2  培养箱内培养。细胞培养24h贴壁,呈梭形成纤维样细胞生长,72h后大量细胞成纤维样生长,部分区域成漩涡样细胞群,见图1。在细胞种植的第4 天第1 次换液,以后每2d换液1 次,细胞生长7~10d 后长满瓶底面积的80%时2.5%胰蛋白酶收集计数并传代。

图1   BM-MSCs倒置显微镜(×200) 图2   PRF 膜状结构
Fig.1  Invertedmicroscope Fig.2   StructureofPRFfilm ofBM-MSCs
1.1.2   富血小板纤维蛋白(PRF)制备   自兔耳缘静脉抽取血液8 mL 收集到不添加抗凝剂的无菌试管中迅速离心,1200r/min 离心10 min,即分为3层,中间层即为PRF,用无菌纱布挤压 PRF,使其成为膜状结构,眼科剪剪成碎片植入普通培养液备用,
见图2。
1.1.3   载蛇床子素-NA 支架材料模型的制备
蛇床子素与羟基磷灰石按1∶1 比例置入直径:1.0 cm,厚:0.3cm 模具中,成 型稳定,称 重 (21±1) mg,制备24颗,待用。
1.1.4   细胞载体复合物的制备   培养第3 代 BM- SCs制成细胞悬液浓度2×10 个/mL 接种于载蛇床子素与 NA 支架材料(1∶1)上,然后培养箱中培养24h,更好的使BMSCs进入支架材料孔隙中。

图3 A、B、C3组 X 线4周
Fig.3   X-rayofA,B,Cgroupsafter4w
图4   A、B、C3组 X 线 12周
Fig.4   X-rayofA,B,Cgroupsafter12w
1.2   手术分组及试验方法
1.2.1   手术分组  36 只新西兰大白兔随机分为3组,每组12只,制备双侧下颌骨缺损模型,A 组植入 BMSCs/PRF 复合载蛇床子素支架材料;B 组植入 BMSCs复合载蛇床子素支架材料,C 组单植入羟支架材料。
1.2.2   试验方法  取兔称重后,20%乌拉坦(5 ml/ kg)耳缘静脉注射麻醉。麻醉显效后常规术区备皮消毒铺巾后沿左侧下颌骨下缘做平行切口,长度3
~4cm,分层切开皮肤皮下组织,暴露下颌骨下缘及颊面,而后用裂钻于下颌骨体颊侧中下处制备骨
缺损,直径1.2cm,深度0.3cm。按手术分组植入不同材料。手术中生理盐水降温,右侧同上。充填完毕,分层严密缝合切口,分笼饲养。术后肌注庆大
霉素预防感染,剂量为2万 U/次,2次/d,持续5d。
1.3   观察指标
1.3.1   大体观察  观察骨缺损区表面情况及新骨形成情况及探测骨表面硬度。
1.3.2   影像学分析  X 线观察骨缺损区密度影的改变及材料与周围组织接触情况。牙 CT 扫描骨缺损区内6个不同位点,并记录 CT 值,取均值并进行统计分析。
1.3.3   组织学观察   于骨缺损区周围0.5 mm 处取材,4%多聚甲醛固定24h后脱钙处理,常规标本


浸蜡,包埋,切片,HE 染色,光镜观察。
1.3.4   扫描电镜观察 将组织块置于4% 戊二醛固定液24h取出,PBS液冲洗3次,梯度乙醇脱水,醋酸异钨酯中置换15 min,JSM-6360LV 扫描电镜检测材料与周围组织密合情况及生物相容性。
1.3.5   计算机图像分析   术后4 个时间段所有组织连续切片,并进行系统选片,每块组织选5 张,光镜100倍下每张切片系统随机选取6 个视野,在图像分析仪下进行组织学形态分析,测定术后各个时
间点上新生骨小梁面积所占修复区面积的比值。
表1 各时间段3组骨缺损区 CT 值测定比较分析
Table1    ComparativeanalysisoftheCT values measuredfortwo
±s 表示,组间、组内差异比较采用t 检验分析,P <
0.05 为差异有显著性意义,见表1、表2。
表2 各时间段两组新生骨占骨缺损面积的百分比
Table2   Thepercentageofthenewboneareaoftotalbonedefects
x珚±s
组别       2周         4周         8周         12周
A 组  39.50±2.52 43.25±1.71 51.50±1.30 62.25±3.76 B组   22.00±2.3430.15 ±3.5141.00 ±3.3147.45±2.13 C组   13.00±1.83 25.00±2.16 31.25±1.26 36.50±3.42
注:与对照组比较,P<0.05
2 结 果
2.1   大体观察  2 周时,A 组材料小部分吸收,界
bonedefects
x珚±s
清,其余两组缺损区有纤维状组织包裹,C 组多见炎
性渗出,3组探测质地均较软;4周时,A 组材料吸收明显,缺损边缘与周边骨结合较牢固,探测质地较
B组   -332±27.79-121±11.62 22±10.31   115±13.23
    C组   -402±22.37-182±26.99 -18±8.04   48±12.68 
注:与对照组比较,P<0.05
1.3.6   统计学方法 使用 SPSS17.0 统计软件对
CT  值及新生骨小梁面积进行统计分析。数据以 x珚
硬,B 组,C 组纤维组织充填较多,质地软;8 周时,A组材料大部吸收,缺损区与周围骨无明显差异,硬度明显增加,B 组残存材料较多,硬度不及实验组;12
周时,A 组缺损区骨膜包被,硬度与周围骨相当,B
组,C 组表面仍有纤维组织,硬度不明显。







图5   A 组扫描电镜12周 图6   B组12周 图7   C组12周
Fig.5   SEM ofAgroupafter12w Fig.6   SEM ofBgroupafter12w Fig.7   SEM ofCgroupafter12w

图8   A 组苏木精- 伊红染色(×200)12周 图9   B组苏木精- 伊红染色(×200)12周 图10   C组苏木精- 伊红染色(×200)12周
Fig.8   HEstainingofAgroupafter12w Fig.9   HEstainingofBgroupafter8w Fig.10   HEstainingofCgroupafter12w

2.2  X 线检测  2 周时,3 组缺损区内低密度影明显,有材料阻射影,与周围骨组织界清;4 周时,A 组可见絮状高密度影,材料可见吸收,硬度增加,与周
围正常骨边界尚清,B、C 组缺损区材料阻射影依旧
清楚,低密度影多,与周围界限清;8 周时,A 组区域可见均匀骨痂影像,有骨性连接,骨密度增加,与周围界限不清,B 组缺损区可见絮状高密度影,骨密度
较低,与周围界限尚清,C 组低密度影明显

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